CoV-2-KomET – Hochdurchsatz-Diagnostik von SARS-CoV-2

Voraussetzung für die Beurteilung von Neuinfektionen mit SARS-CoV-2 ist eine möglichst umfassende Testung. Beim derzeit eingesetzten PCR-Test werden SARS-CoV-2-Nukleinsäuren mithilfe einer sogenannten reversen Transkription in DNA-Moleküle umgeschrieben, mit einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion vervielfacht und analysiert. Der Probendurchsatz der qRT-PCR-Geräte dabei ist limitiert, ebenso deren Verfügbarkeit.

Fraunhofer‑Forschende haben daher ein Nukleinsäure-basiertes Hochdurchsatzverfahren entwickelt, validiert und getestet, um den Probendurchsatz im Vergleich zum Standardverfahren um mindestens eine Größenordnung zu erhöhen.

In diesem neuen Ansatz nutzen die Forschenden die Hochdurchsatzfähigkeit der modernen Sequenziertechnologie: Die verschiedenen Patientenproben sollen nicht einzeln ausgelesen, sondern ein ganzer Pool – mit Proben Tausender Patienten – gleichzeitig sequenziert werden.

Sequenzierer.

Hochdurchsatz-Diagnostik von respiratorischen Erkrankungen wie SARS-CoV-2

Laut Robert-Koch-Institut wurden in Deutschland bisher ca. 14,75 Millionen SARS-CoV-2-Infektionen nachgewiesen [1], eine höhere Dunkelziffer wird vermutet. Die derzeit eingesetzten diagnostischen Verfahren der reversen Transkription viraler Nukleinsäuren mit anschließender quantitativer Polymerase-Kettenreaktion, im allgemeinen als PCR-Test bekannt, sind jedoch hinsichtlich des Probendurchsatzes limitiert. Darüber hinaus steigen auch Infektionen mit anderen saisonalen respiratorischen Erkrankungen wie Influenza oder RSV (Respiratorisches Synzytial-Virus) an [2], welche im besten Fall simultan analysiert und diagnostiziert werden sollten.

 

Prozessablauf zur Hochdurchsatzsequenzierung von gepoolten Patientenproben.
Prozessablauf zur Hochdurchsatzdiagnostik von SARS-CoV-2 in gepoolten Patientenproben, beginnend mit der Probenahme über das molekulare Barcoding in der RT-PCR bis zur Analyse und Evaluierung der Ergebnisse (Grafik erstellt mit BioRender).

Flächendeckende Tests durch Hochdurchsatz-Diagnostik

Um flächendeckende PCR-basierte Tests anbieten zu können, muss der Durchsatz wesentlich erhöht werden. Im Rahmen des Vorhabens »Hochdurchsatz-Diagnostik von SARS-CoV-2« hat das IGB daher in Kooperation mit den Fraunhofer-Instituten für Zelltherapie und Immunologie IZI und für Produktionstechnik und Automatisierung IPA ein neues Verfahren zur Hochdurchsatz-Diagnostik von SARS-CoV-2 entwickelt und an klinischen Proben validiert.

Dabei wird die reversen Transkription und Vermehrung spezifischer Virussequenzen (RT-PCR) mit der Hochdurchsatzfähigkeit moderner Sequenziertechnologien kombiniert. Um tausende Patientenproben gleichzeitig zu analysieren, werden diese in der RT-PCR mit spezifischen Oligonukleotiden – auch als »molekulare Barcodes« bezeichnet – gekennzeichnet, die eine eindeutige Zuordnung zur Probe ermöglichen (siehe Abb.).  

 

Erste Validierung der Hochdurchsatz-Diagnostik

An insgesamt 672 klinischen Proben konnte CoV-2-KomET erfolgreich gestestet werden und erreichte dabei eine Spezifität von über 89 Prozent und eine Sensitivität von über 87 Prozent im Vergleich zur Standardbestimmung des PCR-Tests. Die diagnostische Güte von CoV-2-KomET, bestimmt durch die »Area under the curve (AUC)«, von 94 Prozent zeigt das Potenzial dieses Ansatzes, der zukünftig weiteren Evaluierungen und Verbesserungen unterzogen werden wird.

Neben der reinen SARS-CoV-2 Hochdurchsatz-Detektion konnte des Weiteren an 41 synthetischen Proben ein »respiratorisches Panel« erfolgreich etabliert werden und damit SARS-CoV-2 sowie Influenza A/B bis zu einer Nachweisgrenze von 10 Kopien/µL nachgewiesen werden.


Ausblick

CoV-2-KoMET als diagnostischer Ansatz, basierend auf der Hochdurchsatz-Sequenzierung von Virus-Nukleinsäuren, stellt eine vielversprechende und alternative Methode in Pandemien und bei Infektionsausbrüchen dar. Mit dem Ansatz konnten wir nicht nur den Probendurchsatz erhöhen, sondern durch die Skalierbarkeit auch die potenziellen Kosten pro Testung reduzieren. Darüber hinaus kann durch ein verändertes Design der spezifischen Virussequenzen innerhalb weniger Wochen auf neue Varianten reagiert werden.

Das Projekt wird mit dem industriellen Partner LMV Laboratories weitergeführt, mit einem besonderen Fokus auf der Verbesserung und Erweiterung des respiratorischen Panels, um Patienten möglichst simultan – mittels einer einzigen Probe – auf Infektionen mit SARS-CoV-2, Influenza und RSV zu testen.

Referenzen

[1] RKI Dashboard, Stand 28.02.2022
[2] Buda, S.; Dürrwald, R.; Biere, B.; Reiche, J.; Buchholz, U.; Tolksdorf, K.; Schilling, J.; Goerlitz, L.; Streib, V.; Preuß, U.; Prahm, K.; Haas, W. und die AGI-Studiengruppe (2021) ARE-Wochenbericht – Aktuelles zu akuten respiratorischen Erkrankungen Kalenderwoche 47, Robert Koch-Institut

Projektinformationen

Projekttitel

Clusterprojekt »CoV‑2‑KomET – Nachweis von SARS‑CoV‑2« mit Vorhaben »Hochdurchsatz‑Diagnostik von SARS‑CoV‑2«

 

Projektlaufzeit

September 2020 – November 2021

 

Projektpartner Clusterprojekt

 

Projektförderung

»Fraunhofer vs. Corona« im Rahmen der Internen Programme der Fraunhofer-Gesellschaft, Fördernummer Anti-Corona 840268